实验新知
R&D Systems位于细胞生物学行业领先地位,2009年NATURE系列刊物就有790篇论文使用R&D Systems的产品。高质量的IHC抗体不仅提供低背景高信号的染色结果,而且可以反映组织生理学的真实结果。R& D Systems抗体交叉反应低,特异性高,保证了真实可靠的信号结果。
1. R&D Systems一抗的质量如何?
2. R&D
Systems一抗IHC应用区分石蜡和冰冻切片吗?区分IHC和ICC吗?
R&D Systems抗体经过不同的细胞及组织材料的筛选,能特异性识别石蜡和冰冻切 片中的抗原,IHC和ICC相互通用。
3. 做IHC/ICC, 选择单抗还是多抗?
单抗和多抗的固有特性决定了其优劣势。单抗,由单个B细胞克隆产生的,具有高亲 和力和针对单个抗原表位的特异性。如需检测具有相同氨基酸序列的蛋白家族,单抗就非常适合。单抗和抗原结合的效果取决于抗原能否保持其天然构象。但是抗原的构象一旦由于各种原因发生改变,如由于蛋白相互作用,翻译后修饰,温度,pH,固定,盐浓度等,单抗和抗原结合的效果会受到严重影响。
4.一抗试剂的孵育条件?一抗浓度,温度,时间?
一抗抗体浓度,稀释,孵育时间和温度都会影响染色质量。这些变量需要针对不同抗体和样品进行优化,以达到高特异性,低背景的信号。一般的优化过程是,保持固定的孵育时间和温度,同时改变抗体的浓度以决定最佳的低噪音背景的信号。例如,使用一只高亲特异性抗体,可以使用相对较高的抗体浓度配套较短的孵育时间;或者,相对较低的抗体浓度配套较长的孵育时间。 为促进特异性染色,常选用较长的孵育时间及较低温度下进行(如室温和4°C)。
R&D Systems的染色优化方案: 对于组织切片,起始优化条件是4°C孵育过夜; 对于染色细胞,起始优化条件是室温孵育1小时。经抗原亲和纯化的多抗 (1.7-15
ug/mL) 较单抗(5-25 ug/mL)的工作液浓度低。如使用不同浓度的同一抗体比较样本的染色效果,孵育时间和温度一定要一致。在实验室中使用新抗体时,建议进行预实验测试教广的抗体浓度。
一抗孵育的起始优化条件
样本 | 抗体 | |
单抗 | 多抗 | |
组织 | 5-25ug/mL, 4℃孵育过夜 | 1.7-15ug/mL, 4℃孵育过夜 |
细胞 | 5-25ug/mL, 室温孵育1小时 | 1.7-15ug/mL, 室温孵育1小时 |
优势 | 单抗原表位特异性 | 工作浓度低 |
劣势 | 易受抗原表位的变化影响 | 非特异性高,需经过抗原亲和纯化 |
5.做石蜡切片IHC,推荐什么抗原修复技术?
背景知识:日常工作中所使用的10%福尔马林固定的石蜡包埋组织,经常产生蛋白交联反应遮蔽了组织内某些蛋白抗原,阻碍了抗原与抗体的结合。为了打开蛋白间的交联,使被封闭的抗原充分暴露,抗原修复技术在免疫组化操作过程中是个极其重要的环节,不同抗原修复方法直接影响免疫组织化学染色结果的表达。
R&D Systems建议客户采用热修复的方法,并提供了高度优化的抗原修复试剂,有效修复抗原并提高免疫反应的效果:碱性抗原修复液(Catalog # CTS013), 酸性抗原修复液 (Catalog # CTS014) ,中性pH 7.0抗原修复液(Catalog # CTS015) ,含有前3种修复液的综合修复液 (Catalog # CTS016)。在R&D Systems的实验室中, 我们发现使用碱性抗原修复 (Catalog # CTS013)容易取得良好的修复效果。
抗原未修复 抗原修复后
人小脑组织Neuroplastin 65
一抗:3 μg/mL goat anti-human/mouse Neuroplastin 65 polyclonal antibody :Catalog # AF5360
6.如何做对照?
合适的对照对解释IHC/ICC的结果的真实性是至关重要的。一个令人满意的IHC/ICC实验设计会有力显示抗原位于正确的特定组织,细胞类型,或亚细胞位置。我们推荐:Endogenous Tissue Background
Control,No Primary Antibody Control,Isotype Control,Absorption Control,Tissue Type Control。
7.做IHC,如何避免非特异性染色?如何选择染色试剂盒?
所有IHC/ICC研究具体取决于抗体抗原结合,由疏水作用,离子相互作用,氢键结合以及其他分子间作用力等控制。然而,同样的引力也可能导致非特异性染色,即一抗结合了抗原表位以外的氨基酸。这是在IHC/ICC中是一个常见的问题。我们面临的挑战是减少非特异性相互作用,而不影响抗体的抗原表位结合。
非特异性染色的原因包括一抗和二抗与和血清蛋白的相互作用,抗体和组织间的离子相互作用,能影响IHC检测系统的内源性分子的相互作用。这些问题可能导致高背景从而无法观察到目标蛋白的表达位置。通过使用阻断剂(a blocking
reagent),可以修正非特异性染色体,而这些修正步骤都必须在一抗孵育之前完成。
封闭效果比较:
石蜡包埋的人扁桃体组织CD14
A.未经动物血清封闭 B.使用动物血清室温封闭15分钟
实验试剂:抗人CD14生物素化亲和纯化多抗(货号:BAF383,Sheep IgG),碱性抗原修复液(货号:CTS013),R&D Systems®高敏染色试剂盒(CTS019,Sheep Kit)
内源性过氧化酶的影响
A. 未灭活内源性过氧化酶 B. 过氧化酶灭活试剂处理15分钟
R&D Systems® 高敏IHC染色试剂盒(Cell and Tissue Staining Kit)是基于LSAB原理的高度优化试剂盒。高敏IHC染色试剂盒在原料上选用高特异性生物素二抗,高灵敏链酶亲和素链接酶(HS Streptavidin-HRP)。高灵敏链酶亲和素链接酶(HS Streptavidin-HRP)不与磷脂,核酸,及糖类结合蛋白结合,只与生物素化二抗节后,降低实验背景;染色试剂盒提供的4种封闭试剂(过氧化酶, 亲和素,生物素, 血清)能有效预防非特异性染色。
Molecule |
Species |
Description |
Cat.No. |
Size |
HRP-AEC |
Goat |
Cell&Tissue Stain Kiit |
CTS009 |
50Tests |
HRP-DAB |
Goat |
Cell&Tissue Stain Kiit |
CTS008 |
50Tests |
HRP-AEC |
Mouse |
Cell&Tissue Stain Kiit |
CTS003 |
50Tests |
HRP-DAB |
Mouse |
Cell&Tissue Stain Kiit |
CTS002 |
50Tests |
HRP-AEC |
Rabbit |
Cell&Tissue Stain Kiit |
CTS006 |
50Tests |
HRP-DAB |
Rabbit |
Cell&Tissue Stain Kiit |
CTS005 |
50Tests |
HRP-AEC |
Rat |
Cell&Tissue Stain Kiit |
CTS018 |
50Tests |
HRP-DAB |
Rat |
Cell&Tissue Stain Kiit |
CTS017 |
50Tests |
HRP-DAB |
Sheep |
Cell&Tissue Stain Kiit |
CTS019 |
50Tests |
HRP-DAB |
Sheep |
Cell&Tissue Stain Kiit |
CTS020 |
50Tests |
优点 即开即用
高检测灵敏度
适合冰冻切片,石蜡包埋切片,悬浮细胞等,
适合细胞涂片(cytospin)(如淋巴细胞,单核细胞,转染细胞)
适合多种一抗,如goat, mouse, rabbit, rat, sheep IgG.
组分 4种封闭试剂(过氧化酶, 亲和素,生物素, 血清)
高特异性生物素二抗
高灵敏链酶亲和素HRP(HS Streptavidin-HRP)
DAB (褐色) or AEC (红色) 染料和缓冲液
8.做ICC,如何选择荧光二抗?
NorthernLights荧光抗体耐光漂白,明亮,是多色荧光显微的理想选择。他们的光谱接近几个常用的荧光染料,可与普通过滤器设备或激光器配套使用(见下表)。
优点 明亮、不易褪色
特异信号强
在酒精和二甲苯中稳定
应用于荧光显微镜(ICC)、免疫组化(IHC) 、流式细胞仪(Flow Cytometry) 等。
NorthernLights 2th Antibody |
Cat.No. |
Abs/Em Maxima |
Laser(Ex) |
Fluorochromes(Abs/Em) |
NL-493 anti-sheep IgG |
493/514 |
Argon (488) |
FITC (492/520) (494/519)
|
|
NL-493 anti-Rabbit IgG |
||||
NL-493 anti-Mouse IgG |
||||
NL-493 anti-Rat IgG |
||||
NL-493 anti-Goat IgG |
||||
NL-493 Streptavidin |
||||
NL-493 anti-Chicken IgY |
||||
NL-557 anti-sheep IgG |
557/574 |
Rypton (568) HeNe (543) |
Phycoerythrin
(565/575)
|
|
NL-557 anti-Rabbit IgG |
||||
NL-557 anti-Mouse IgG |
||||
NL-557 anti-Rat IgG |
||||
NL-557 anti-Goat IgG |
||||
NL-557 Streptavidin |
||||
NL-557 anti-Chicken IgY |
||||
NL-637 anti-sheep IgG |
637/658 |
HeNe (633) |
Allophycocyanin (645-660)
(650-668) |
|
NL-637 anti-Rabbit IgG |
||||
NL-637 anti-Mouse IgG |
||||
NL-637 anti-Rat IgG |
||||
NL-637 anti-Goat IgG |
||||
NL-637 Streptavidin |
||||
NL-637 anti-Chicken IgY |
9.DAB染色信号微弱,需要增强免疫染色?
为更好的将抗原抗体结合的微弱信号进行有效的放大,使很多以前表达较弱的抗原加强染色效果;DAB 增强试剂Catalog # CTS010(浓度为50X ,3 mL)可以加强DAB 染色。使用DAB 增强试剂后, DAB 染色产生灰黑色的染色且背景低。
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